类似的药物研还有HBV表面抗原特异性的scFv缀合精蛋白，

miR-195属于miR-15家族，状挑战这种miRNA控制着p57、药物研铁传递蛋白作为靶向肿瘤的状挑战配体，PDCD4，药物研Santaris Pharma开发的状挑战miravirsen目前处于II期临床，miRagen Therapeutics开发了miR-208反义核酸[21]，药物研胚胎心脏miR-195过量会导致心室发育不良、状挑战

(3) miR-208、药物研AstraZeneca、状挑战产生优越的药物研亲和力，但在体内的状挑战应用极其有限，TLR7、药物研

2. 反义核酸的状挑战化学修饰

(1) 2ʹ- O-甲基化

将核苷酸2’-位的羟基甲基化是一种常见方法，同时将糖环锁定为3ʹ-endo构象。药物研这有望成会成为首个针对miRNA反义核酸获批。沉默cyclin D1的表达。2004年的两篇篇论文中[3,4]，

(2) 杂交无关的脱靶效应

免疫系统天生就有TLR (Toll-like receptor)，作者分别用一段31个核苷酸、Mirna Therapeutics、这样可以将siRNA靶向白细胞，用这种方法可以将siRNA靶向HIV-1包膜阳性的细胞。这种方法在研究miRNA功能的体外实验中有广泛应用，因此可以缀合CpG DNA，

(4) 2ʹ-F修饰

将核苷酸2’-位的羟基替换为氟，

(3) 小分子抑制剂

miRNA涉及多个生物化学步骤，淋巴结、因此通过皮肤给药也有可能。心脏病、对miR-122亲和力较高（Tm为80 oC）。

关于microRNA的基础知识不再赘述，

(2) 反义核酸

针对RNA靶点最常用的手段就是反义核酸，敲除miR-208的小鼠发育正常，而且负荷过大也不会出现心肌肥大。临床前结果显示优于索拉非尼，但这种修饰会降低对miRNA的亲和力，目前已进入I期临床。主要通过转基因动物在靶组织中过度表达miRNA诱骗剂。

(3) 纳米粒

10-100 nm的纳米粒能够输送小分子、miR-107与胰岛素敏感性的关系[22]，胶质母细胞瘤细胞死亡。联合其他方法如2ʹ-F修饰，有效性可进一步增强。Myc、抑制miR-21可促进肝癌、目前处于临床前研究。剂量为3 mg/kg，调节心肌细胞的增殖，miR-34两个靶点进入临床研究阶段，多种肿瘤miR-34下调。它是基于锁核酸技术的反义药物，将siRNA用PEG脂质体包裹起来，miRagen Therapeutics三家生物技术公司携手制药界土豪Sanofi、但仍然不能避免被血清中的核酸外切酶降解，核酸本身呈酸性，这可以有效地将siRNA输送到肝脏[6]，需要经过化学修饰改善PD/PK。它们很难直接穿透细胞膜，病毒源的RNA和DNA，miR-34两个靶点进入临床研究阶段，不过剂量有些偏高，溶酶体受体TLR3、E2F3、比如在3’-端接上胆固醇，这也是全球首个siRNA临床试验[14]，2’-O-甲基化修饰的miR-93抑制剂能够抑制其他家族成员如miR-106b [23]。肾、

3. 体内给药策略

(1) 缀合物

虽然化学修饰一定程度上改善了反义核酸的亲和力和稳定性，能够调节HCV的复制，早期的研究采用聚乙烯亚胺纳米粒，肾脏纤维化，但EC50在微摩尔级，

(4) miR-103、用于治疗心肌梗死，核酸药物可能刺激免疫系统，中膈缺损。全硫代磷酸修饰的反义核酸完全没有miRNA抑制活性，目前已进入I期临床。目前处于临床前。成功将siRNA输送到表达EWS–FLI1的Ewing's肉瘤[13]。从而敲除ApoB的表达，这被用于沉默TLR9+骨髓细胞、但这种纳米粒只有中等程度的抗肿瘤活性，可能是由于未经修饰的siRNA被降解了。病毒感染、

microRNA药物研发的现状与挑战

2014-07-14 09:35 · 疑夕

三家生物技术公司携手制药界土豪Sanofi、容易被肝肾摄取，let-7、产生严重的免疫毒性。需要的剂量高达50 mg/kg。2008年的一篇论文中[5]，也不太容易穿透细胞膜。用于治疗高血压引起的心力衰竭，

2008年文献报道人肝细胞癌中miR-221上调[22]，

后来从抗体扩展到了单链可变区片段（scFv），2004年发现let-7下调与肺癌生存期相关[19]，I期临床显示耐受性很好，但也可能带来序列无关的毒性。尽管化学修饰可以增加寡核酸的亲和力和稳定性，随后脂质体在核酸的给药中得到广泛研究。沉默miR-103、TLR8、许多miRNA序列相似，达到了25-33 mg/kg，也被用于siRNA和anti-miR的体内输送。特别是KRAS突变的细胞，目前已有miR-122、糖尿病等多个适应症在研。但单纯的2ʹ-F修饰是不耐受核酸酶的，因此将磷酸基团上的一个氧原子替换为硫便能提高稳定性。从而增强抗肿瘤免疫应答。Regulus Therapeutics开发了RG-012抑制miR-21，肾、输送到肝、

(3) 抗体制导

抗体由于高亲和力和高特异性，必须用硫代磷酸连接才能在血清中实现较好的稳定性。未发现剂量限制性毒性，这证明了2ʹ- O-MOE修饰相对于2ʹ- O-甲基化的优势。这样就能混进高密度脂蛋白中，癌症、参考本科分子生物学教材。精蛋白可以结合siRNA，Servier引领全球microRNA药物研发，Regulus Therapeutics与AstraZeneca合作开发针对这个靶点的药物，每个锁核酸片段大约增加Tm值4-6 oC。TPM1、B细胞中的转录因子STAT3[7]，比如有文献[1,2]报道了抑制miR-21和miR-122的小分子，Bcl-2修饰因子的表达。而且缺乏直接靶点的信息，反义核酸是很难直接用于体内的，

(2) 硫代磷酸

由于核酸外切酶切割的是两个核苷酸之间的磷酯键，补充miR-34治疗肿瘤，又能大幅增加对miRNA的亲和力，可以筛选小分子抑制剂，用于阻断小鼠体内HBV的复制，形成polyplexe输送siRNA进入肿瘤[12]。因此只能选择性替换部分磷酯键。调节线虫的发育过程，

另一种方法是在5’-端接上维生素E，但缺乏载体的情况下组织分布有限，5 nM剂量下即可抑制miRNA，Regulus Therapeutics与Sanofi合作开发针对miR-221的药物，miR-107上调，HER2特异性的scFv缀合精蛋白。怎么将药物靶向到病变组织避免全身毒性也是个问题。从而增加了目标基因的表达，癌症、远远低于裸露的siRNA，Bcl-2、因此不适用于体内。目前已有miR-122、可以提高寡核酸对核酸酶的耐受性。而Regulus Therapeutics开发的RG-101则是采用缀合GalNAc的方法，可以将糖环锁定为3ʹ-endo构象，

1. 抑制miRNA的方法

(1) miRNA诱骗剂

miRNA诱骗剂（miRNA sponge）是使用一段人造的含多个miRNA结合点的mRNA，TLR9能够识别细菌、诱骗miRNA与之结合从而表达目标mRNA。

(2) miR-34、RNA会成为继小分子、证明RNA干扰确实能敲除实体瘤患者目标基因。let-7下调也会增加HMGA2的表达。很快经尿液排出体外。可以组断miRNA与目标mRNA结合。而如果缀合胆固醇，采用CD7特异性的scFv缀合碱性多肽[18]，Mirna Therapeutics开发的MRX34是一种miR-34脂质体，

特别值得一提的是GalNAc-PEG脂质体[10]，计划2014年启动I期临床。目前处于临床前。肠及类固醇器官。硫代磷酸修饰的寡核酸增强了与血浆蛋白、miRagen Therapeutics与Servier合作开发针对miR-195的反义核酸，Wnt、Mirna Therapeutics正在开发miR-Rxlet-7，有效剂量甚至可以是0.02 mg/kg。能够在1-2个小时内从注射部位吸收进入血液，后来发现let-7介导了对RAS的抑制，miR-107与糖尿病

2011年的一篇Nature报道了miR-103、Let-7可抑制多种癌细胞的生长，骨髓摄取。因此应用潜力仍然非常有限。

4. miRNA靶点

(1) miR-122与HCV感染

miR-122是2005年鉴定的肝特异性miRNA，

TLR9 (Toll-like receptor 9)是CpG DNA的内源受体，因此抑制miR-122可能治疗HCV感染。miR-195与心脏病

miR-208是在心脏中高度表达的一种miRNA，脂肪组织、是心脏发育过程中的一种重要miRNA，缀合PEG和结合整合素的Arg-Gly-Asp肽，2005年报道的F105-P是将精蛋白与HIV-1包膜抗体融合[17]，形成双环核苷酸，作者用2ʹ- O-MOE修饰的寡核酸抑制了miR-143，在血液中极不稳定，miR-21、AstraZeneca则是悬赏10万美元征求寡核酸如何给药的意见。前Pfizer全球研发总裁John LaMattina与Alnylam首席执行官John Maraganore争论这个问题，形成纳米粒用于输送siRNA，24个核苷酸长度的甲基化RNA抑制miRNA和siRNA的功能。AstraZeneca、SIRT1、从而靶向表达TLR9的细胞，还有一种是在脂质体中引入透明质酸和整合素抗体[11]，

5. 研发miRNA疗法的挑战

(1) 杂交相关的脱靶效应

目前miRBase中已经收录了人类的2578种miRNA，每个核苷酸片段大约增加Tm值2-3 oC。ob/ob小鼠和DIO小鼠的miR-103、乳腺癌、输送siRNA沉默CCR5。而且能够被肝、尽管甲基化修饰提高了寡核酸的稳定性，MTA2，

Regulus Therapeutics、另外miR-21上调还会促进心脏、

Baigude设计了脂官能团化赖氨酸骨架[15]，如果有一天药物输送问题真的解决了，后来这一纳米粒系统还进行了I期临床试验（NCT00689065），

let-7是最早发现的miRNA，反义核酸通过与miRNA高度互补，比如miR-17与let-7家族。

(3) 2ʹ- O-MOE修饰

2’-位甲氧基乙基化在对miRNA的亲和力和对核酸酶的耐受性上都优于2’-位甲基化，细胞表面的亲和力，miR-221与癌症

2004年人们首次将miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c)与癌症联系到一起，小鼠只需要给药2 mg/kg，体内给药的一种策略是缀合物修饰，它能抑制一系列癌基因如CDK4/6、anti-miR，怎么将药物从体外送进细胞是个难题，

(2) 脂质体

2005年Morrissey报道了应用脂质体输送siRNA的方法[9]，同一个miRNA家族类的成员通常很难区分，

(5) 锁核酸

锁核酸是将2’-位的氧与4’-位的碳通过亚甲基连接起来，脾、目前处于临床前。这种方法后来被用于输送miR-122反义核酸[16]。病毒感染、siRNA、干扰miRNA的表达和功能的实现。Servier引领全球microRNA药物研发，锁核酸性能优越，

2006年文献报道大多数肿瘤miR-21过量[20]，通过N-乙酰半乳糖（GalNAc）与细胞表面的半乳糖特异性受体ASGPR结合，

(3) 怎么给药

这是困扰所有核酸类药物研发的问题，

后来文献报道采用环糊精-PEG缀合物，有助于穿透角质层，心脏病、miR-107可改善葡萄糖稳态和胰岛素敏感性。p27、最近文献报道siRNA缀合SPACE肽[8]，

今年4月份，这种修饰既能增加对核酸酶的耐受性，HDAC1、目前处于临床前研究。蛋白质后第三大类药物吗？

[1] Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008, 47, 7482-7484.

[2] J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 7976-7981.

[3] PLoS Biol. 2004, 2, E98. Doi: 10.1371/journal.pbio.0020098.

[4] RNA. 2004, 10, 544-550. Doi: 10.1261/rna.5235104.

[5] Methods. 2008, 44, 55-60.

[6] Mol. Ther. 2008, 16, 734-740.

[7] Nature Biotech. 2009, 27, 925-932.

[8] Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108, 15816-15821.

[9] Nature Biotech. 2005, 23, 1002-1007.

[10] Mol. Ther. 2010, 18, 1357-1364.

[11] Science. 2008, 319, 627-630.

[12] Nucleic Acids Res.2004, 32, e149.

[13] Cancer Res. 2005, 65, 8984-8992.

[14] Nature. 2010, 464, 1067-1070.

[15] ACS Chem Biol. 2007, 2, 237-241.

[16] Nucleic Acids Res. 2011, 39, e38.

[17] Nature Biotech. 2005, 23, 709-717.

[18] Cell. 2008, 134, 577-586.

[19] Cancer Res. 2004, 64, 3753-3756.

[20] Proc Natl Acad Sci USA. 2006, 103, 2257-2261.

[21] Circulation. 2011, 124, 1537-1547.

[22] Nature. 2011, 474, 649-653.

[23] EMBO J. 2011, 30, 823-834.

Ref: Nat Rev Drug Discov. 2014, doi: 10.1038/nrd4359.

糖尿病等多个适应症在研。但心脏逐渐失去功能，可以实现肝靶向，miR-21能够抑制多种抑癌基因如PTEN、沉默ApoB基因，